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研究miR-372-ZBTB7A訊息軸之下游基因VGF在口腔癌中的功能性角色

為了解決cero藥物的問題，作者林依宁 這樣論述：

誌謝 i中文摘要 iiAbstract iii目錄 iv壹、緒論 (Introduction) 1一、頭頸部鱗狀細胞癌 (Head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC) 1二、微型核醣核酸 (microRNA, miRNA) 2三、miR-372 3四、ZBTB7A (Zinc finger and BTB domain-containing protein 7A) 3五、VGF (VGF Nerve growth factor inducible) 4貳、研究動機及目標 (Purpose

) 7一、研究動機： 7二、研究目標： 8參、實驗材料與方法 (Material and Method) 9一、細胞培養 (Cell Culture) 9二、轉染 (Transfection) 11三、製備病毒 (Virus preparation) 12四、病毒感染 (Virus infection) 14五、gDNA 萃取 (genomic DNA extraction) 14六、mRNA萃取 (mRNA extraction) 15七、mRNA反轉錄聚合酶鏈鎖反應 (Reverse transcriptase-PCR) 1

6八、微型RNA 反轉錄聚合酶鏈鎖反應 (miRNA stem-looped TaqMan-RT-PCR) 17九、定量聚合酶鏈鎖反應 (Real-time PCR) 17十、西方墨點法 (Western blot) 19十一、細胞生長分析 (Proliferation assay) 22十二、細胞爬痕移行分析 (Wound healing migration assay) 23十三、細胞侵襲分析 (Matrigel invasion assay) 24十四、細胞非貼附生長分析 (Anchorage-independent growth assay)

25十五、質體構築 (Construct of plasmid) 26十六、瓊脂膠體萃取 (Gel extraction) 30十七、熱休克轉型作用 (Heat shock transformation) 30十八、少量質體DNA製備 (Mini plasmid DNA purification) 31十九、大量質體DNA製備 (Midi plasmid DNA purification) 32二十、報導基因分析 (Reporter assay) 33二十一、條件式培養液 (Conditional medium) 34二十二、氯醋酸沉澱 (TCA, T

richloroacetic acid precipitation) 35二十三、酵素免疫分析法 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA) 35二十四、細胞增殖分析 (BrdU assay) 36二十五、流式細胞儀分選儀 (Cell sorting cytometer) 37二十六、JASPAR 數據庫之使用 (The JASPAR database) 38二十七、統計分析 (Statistical analysis) 38肆、實驗結果 (Results) 39一、RNA定序及資料庫分析中發現VGF可能為ZB

TB7A下游基因 39二、建立VGF過度表達及低下表達之口腔癌穩定細胞株 39三、檢測口腔癌細胞株中VGF分泌量及對細胞環境的影響 40四、檢測VGF低下表達及過度表達細胞株之細胞表現型 41五、確認ZBTB7A下游基因VGF 42六、ZBTB7A直接結合到VGF促進子 43七、確認miR-372-ZBTB7A-VGF訊息軸 44八、口腔癌病患檢體中VGF表現量高 44九、ZBTB7A表現量低及VGF表現量高之病人存活率較低 45伍、討論 (Discussion) 46陸、結果圖表 (Figures and Legends) 5

2圖一、找出ZBTB7A其可能的下游基因VGF 52圖二、ZBTB7A口腔癌穩定細胞株中VGF表現呈負相關 53圖三、建立VGF過度表達之口腔癌細胞株 54圖四、建立VGF低下表達之口腔癌細胞株 55圖五、以ELISA檢測口腔癌細胞株中VGF分泌量 56圖六、以西方墨點法偵測分泌至細胞外之VGF 57圖七、VGF過度表達細胞株VGF各isoform分泌量上升 58圖八、VGF穩定細胞株之條件式培養液影響牙髓間質細胞生長 60圖九、VGF穩定細胞株之條件式培養液影響NOK細胞生長 61圖十、檢測VGF低下表達及過度表達穩定細胞株之生長情形

62圖十一、檢測VGF低下表達及過度表達穩定細胞株之細胞表現型 64圖十二、VGF過度表達細胞株-SAS藥物處理後敏感性較差 66圖十三、VGF過度表達細胞株-FaDu藥物處理後敏感性較差 68圖十四、ZBTB7A低下表達穩定細胞株上調VGF表現量 69圖十五、轉染ZBTB7A高度表達質體之細胞下調 VGF表現量 70圖十六、轉染ZBTB7A之si-RNA的細胞上調 VGF表現量 71圖十七、以ELISA檢測ZBTB7A低下表達及高度表達穩定細胞株中VGF分泌量 72圖十八、VGF促進子之質體構築 74圖十九、ZBTB7A直接結合到VGF促進

子而抑制轉錄作用 75圖二十、轉染miR-372抑制劑之細胞下調VGF表現量 76圖二十一、轉染miR-372類似物之細胞上調VGF表現量 77圖二十二、相對惡性之口腔癌細胞VGF表現量高 78圖二十三、口腔癌病患檢體中VGF表現量高 79圖二十四、口腔癌病患檢體中miR-372及VGF表現量高 80圖二十五、ZBTB7A表現量低及VGF表現量高之病人存活率較低 81圖二十六、口腔癌細胞中miR-372-ZBTB7A-VGF訊息傳遞軸扮演重要角色 82柒、附表 (Supplementary Tables) 83附表一、西方墨點法實驗所用之抗

體 83附表二、西方墨點法膠體配置比例 84附表三、使用引子之序列 85捌、附圖 (Supplementary Figures) 86附圖一、ZBTB7A低下表達之細胞生長較為快速 86附圖二、ZBTB7A低下表達之細胞表現型較為惡性 87附圖三、條件式培養液處理示意圖 88附圖四、條件式培養液處理dental mesenchymal cells之細胞型態 89附圖五、製造病毒之pCMV-△-R8.91質體 90附圖六、製造病毒之pMD.G質體 91附圖七、構築VGF過度表達之pBABE-puro載體 92附圖八、NCBI資料庫

找出VGF編碼序列及3’UTR設計正反股引子 93附圖九、報導基因分析使用之載體 94附圖十、VGF促進子之序列 95玖、參考文獻 (References) 96

牛樟木材成分及其對牛樟芝菌絲體生長促進作用

為了解決cero藥物的問題，作者沈奕宏 這樣論述：

牛樟 (Cinnamomum kanehirae Hayata) 為台灣樟科之特有種植物，屬於常綠闊葉大喬木，生長於四百五十至兩千公尺之間的中海拔地區。保健食品中使用的牛樟芝 (Antrodia cinnamomea Chang & Chou) 就是生長在台灣特有的牛樟樹上，由於牛樟芝的菌種只生長在牛樟木內，因此牛樟芝亦為台灣特有之真菌類。 本實驗取牛樟木材以甲醇萃取後，以乙酸乙酯與水進行液-液分配萃取，得到乙酸乙酯層、沉澱物和水層三個劃分部；將乙酸乙酯層與沉澱物分別以Sephadex LH-20, silica gel, LiChroprep RP-18等材質的管柱進行成分分離純化，

再經由核磁共振光譜 (nuclear magnetic resonance) 進行結構鑑定，從牛樟乙酸乙酯層中共分離純化出sesamin, 4-hydroxysesamin, quercetin, taxifolin, (R)-(+)-5-(2,3-dihydroxypropyl)-1,3-benzodioxole, cis-1,4-dihydroxy-1-isopropyl-4-methylcyclohexane等六種成分，並分析其抗氧化、抗發炎、抗肝癌以及牛樟芝菌絲體生長促進表現。 將牛樟各劃分部及六種成分進行DPPH、ABTS.+、磷鉬酸還原力、總還力試驗。各劃分部以乙酸乙酯層及沉

澱物有較好的抗氧化及還原能力六種成分在清除DPPH、ABTS.+自由基以quercetin及taxifolin效果較好，其SC50在DPPH試驗分別為26.96 ± 1.23 μM及42.82 ± 3.22，在ABTS.+自由基試驗分別為18.88 ± 0.50 μM及18.88 ± 0.50 μM。在還原力試驗中，此兩樣化合物亦有良好的還原能力。抗發炎試驗以抑制LPS誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7產生NO進行試驗，結果顯示quercetin為六個成分中最好，在濃度50 μg/ ml抑制率為59.02%。在人類肝癌細胞 (HepG2) 毒殺試驗中以MTT試驗細胞存活率，結果發現其中以sesa

min及4-hydroxysesamin具有較佳抗癌活性，其IC50 分別為29.55 ± 3.91 μM及39.33 ± 3.53 μM。 牛樟芝促進生長作用試驗使用四種牛樟芝菌株BCRC37848、BCRC37849、BCRC37850及Chu1030615以sesamin、4-hydroxysesamin、quercetin、cis-1,4-dihydroxy-1-isopropyl-4-methylcyclohexane各配製三種不同濃度以及三種精油 (水蒸氣蒸餾精油、市售精油(沉水)、市售精油(浮水)) 配製不同濃度之精油加入培養基做比較。發現當加入sesamin、4-hydr

oxysesamin、quercetin在10 µg/ ml生長情況較其他濃度好cis-1,4-dihydroxy-1-isopropyl-4-methylcyclohexane在三種不同濃度下生長情況均較差，推測其具有抑制生長作用，不同濃度的精油試驗則以水蒸氣蒸餾精油在0.01% 的濃度下有最好的生長曲線。 綜合以上結果可知，牛樟木所分離純化的化合物具有抗氧化的能力，同時其中有些成分也具有抑制發炎的活性及促進樟芝菌絲體之成長，因此將來可以更進一步的探討牛樟木的其他成分或是其他的藥用價值。